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产品说明：
CCK8试剂盒提供了一种灵敏度高，操作简便，使用安全，重现性好的细胞增殖与活性检测方法。与传统的MTT相比无需有机溶剂和放射性同位素，步骤少，无损失，结果准确！本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。
1.本试剂无毒，使用中无需有机溶剂，操作更加安全。
2.酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰(扣除空白孔即可)。
一：通用操作步骤
6.在96孔板每孔加入100μL细胞悬液；
7.在培养箱中预培养细胞；
8.向培养板中加入药物(如果不加药物，直接进行第五步操作)；
9.在培养箱中培养一段时间；
10.向每孔加入10μL的CCK-8溶液；
11.将培养板在培养箱内孵育1～4小时(根据具体实验优化)；
12.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
二：制作标准曲线(测定细胞具体数量时)
1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
2.按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3～5个细胞浓度梯度，每组3～6个复孔；
3.接种后培养2～4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间)。
三：细胞活性检测
1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37℃,5% CO2的条件下)；
2.向每孔加入10μL的CCK -8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)；
3.将培养板在培养箱内孵育1～4小时；
4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度；
5.如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
四：细胞增值-毒性检测
使用方法(以96孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排)：
1.在96孔板中配置100μL的细胞悬液(通常细胞增殖实验每孔加入100μL 2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μL 5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养(在37℃，5%CO2,，的条件下)预培养24小时；
2.向培养板加入1～10μL不同浓度的待测药物刺激；
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时)；
每孔加入10μlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。如果起始的培养体积为200μL，则需加入20μL CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；
5.在细胞培养箱内继续孵育1～4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验；
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420～480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定；
7.如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化；
8.注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基
中加入药物后的空白吸收即可。
五：活?计算
细胞活力*(％)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100
A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
六：细胞增殖分析
1.制备细胞悬液；
2.接种到96孔培养板；
3.37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养24小时，不需要贴壁的话，可以省去这个步骤；
4.加入10μL的CCK-8:由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀；
5.培养1～4小时：细胞的种类不一样，形成的Formazan的量也不一样，如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件，特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间(5～6小时)，如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以帮助混匀；
6.测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450～490nm，参比波长600～650nm。
七：细胞毒性分析
1.制备细胞悬液；
2.接种到96孔培养板；
3.37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养24小时，不需要贴壁的话，可以省去这个步骤；
4.加入不同浓度的毒性物质；
5.加入10μL的CCK-8：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的周期；
6.培养1～4小时：由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀；
7.测定450nm吸光度：如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以混匀，
建议采用双波长进行测定，检测波长450～490nm，参比波长600～650nm；
8.IC50的计算方法：
按照以下公式计算细胞存活率，绘制成图表，细胞存活率50%的值即为IC50.
细胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%
As:实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、毒性物质)
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有毒性物质)
Ab：空白孔(不含细胞和毒性物质的培养基、CCK-8)
八：注意事项
1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发；
2.CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影
响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可；
3.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间；
4.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要查到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰OD值读数；
5.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔，(100μL培养基)，且培养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液；
6.加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或PH值变化。建议换用新鲜的培养基；
7.如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430～490nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高；
8.酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
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